【摘要】

背景：糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是由多种病因引起的终身性代谢疾病,以慢性血糖升高为特征。长期的血糖升高会使人的大血管及微血管受到损害并且危及心脏、大脑、肾脏、视网膜、周围神经和足等,对人的生命健康造成了极其严重的损害。作为最常见的慢性疾病之一,糖尿病的患病率正逐年递增。2010年,世界成年人糖尿病患病率为6.4%,患病人数为2.85亿,预测到2030年其患病率将达到7.7%,患病人数达到4.39亿。而中国可能是糖尿病患者最多的国家,2007年时糖尿病的患病率为9.7%,患病人数约为0.9亿；到2010年时,我国成年人糖尿病的患病率达到11.2%,患病人数达到1.1亿左右。如此快速的增长率使糖尿病成为了中国乃至世界不容忽视的公共卫生问题。糖尿病包括四种类型,其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者人数最多。2型糖尿病的主要病理生理特点为胰岛β细胞功能不足和胰岛素抵抗。T2DM是一种慢性、难治性疾病,严重威胁人类健康,而胰岛β细胞功能减退是糖尿病发病过程中最重要的因素,因此保护好T2DM患者残存的β细胞功能是患者长期控制好血糖的关键。通过对肥胖和非肥胖型糖耐量正常、空腹血糖异常和和T2DM者胰岛β细胞体积、β细胞凋亡和增殖、新生胰岛的研究,发现与糖耐量正常者相比,胰岛β细胞体积在肥胖型空腹血糖异常者减少40%、T2DM减少63%,非肥胖型T2DM减少41%。β细胞几乎无增殖,新生胰岛肥胖者略增加。但细胞凋亡却存在明显差异,非肥胖型T2DMβ细胞凋亡是糖耐量正常者10倍、肥胖型增加3倍。这说明T2DM者胰岛β细胞功能减退是由于胰岛β细胞凋亡增加使β细胞体积减少所致。运动是T2DM重要的防治措施之一,而最近发现的肌肉细胞产生的细胞因子irisin可能与运动防治T2DM存在内在联系。Irisin是由包含Ⅲ型纤连蛋白重复序列基因家族中的一员-FNDC5(也称为FRCP2或PeP)裂解释放产生,肌肉组织是irisin产生的主要组织,运动后其分泌增加。运动激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1 α (peroxisome proliferators-activated receptor-y coactivator-1, PGC-1 a)和解偶联蛋白1 (uncoupling protein-1,UCP1),从而激活线粒体膜上的质子运输链,导致AT P合成减少及以热能形式消耗的能量增加,进而可以减轻体重,并提高胰岛素敏感性。临床研究发现长病程和新诊断糖尿病患者以及代谢综合征和空腹血糖受损的患者其irisin水平降低。Irisin可能通过p38丝裂原活化蛋白激酶β38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)和细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)介导的信号通路来上调PGC-1α和UCP1。因此,p38 MAPK和ERK信号转导通路在irisin介导的白色脂肪组织“棕色化”过程中起着重要作用。Betatrophin是新发现的一种肝细胞因子,也被称为血管生成素样蛋白-8(angiopoietin-like protein 8, ANGPTL-8)、肝细胞癌相关蛋白-TD26(hepatocellular carcinoma-associated protein-TD26)、再摄食诱导的脂肪和肝脏蛋白(refeeding-induced fat and liver protein, RIFL)和lipasin。动物研究发现betatrophin主要在小鼠肝脏和脂肪组织中表达,有促进胰岛β细胞增殖和改善代谢调节的作用,但其结果目前还存有质疑,仍需继续深入研究。Betatrophin还参与脂质代谢,其过度表达可以增加血清甘油三酯(triglyceride, TG)水平,并抑制脂蛋白脂酶活性(lipoprteinlipase, LPL)。此外,betatrophin敲除的小鼠其血清TG水平只有野生型小鼠的三分之一。目前关于betatrophin的临床研究结果不一,有研究发现2型糖尿病患者血清betatrophin水平高于糖耐量正常(normal glucose tolerance, NGT)人群,但也有研究发现与NGT人群相比,T2DM患者betatrophin水平并无改变,甚至降低。Irisin改善胰岛素抵抗和betatrophin与胰岛β细胞的关系引起人们的极大关注。胰岛β细胞分泌胰岛素,肝细胞、脂肪细胞和肌肉细胞作为胰岛素作用的靶细胞,是否通过irisin和betatrophin发挥相互作用、互相影响呢?人体内长期存在的轻度炎症以及致炎症因子(如TNF-α)在T2DM胰岛β细胞凋亡中发挥重要作用,而运动肌肉收缩时产生的肌细胞因子发挥了抗炎症作用。那么肌细胞因子Irisin在TNF-α引起T2DM胰岛β细胞凋亡扮演哪种角色及其分子机制,目前尚不清楚。因此,本研究的主要目的在于探讨不同糖耐量人群循环betatrophin水平和irsin的关系以及在性别上的差异,同时体外研究irisin能否促进胰岛β细胞的增殖。

目的：1.探讨新诊断2型糖尿病患者和糖耐量正常人群血清betatrophin和irsin水平以及相关性。2.探讨新诊断2型糖尿病患者和糖耐量正常人群中血清betatrophin和irsin水平在性别分布上的差异,及其二者之间的关系。3.通过体外培养大鼠胰岛瘤细胞(INS-1),研究Irisin能否促进胰岛β细胞的增殖。

材料和方法：1.研究对象(1)于2012年12月—2013年9月招募上海市奉贤区常住中年居民460名,其中新诊断为2型糖尿病的患者60名,糖耐量正常人群254名,糖尿病前期146名。2型糖尿病患者中体质指数在18-28kg／m2有50名作为T2DM组,选取与其年龄、性别和BMI相匹配的糖耐量正常(NGT)者50名作为NGT组。其中T2DM组中男性23名,女性27名：NGT组男性21名,女性29名。根据1999年世界卫生组织糖尿病诊断标准诊断2型糖尿病。排除标准：无妊娠期糖尿病史,急慢性感染性疾病,恶性肿瘤,严重的心脑血管、肝肾疾病等。本研究经南方医科大学附属奉贤医院医学伦理道德委员会批准,所有受试者均签署知情同意书。(2)通过体外培养大鼠胰岛瘤细胞(INS-1),探索Irisin预处理INS-1细胞株的最佳浓度和时间,研究Irisin能否促进胰岛β细胞的增殖。其中,INS-1细胞株购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。2.研究方法(1)由专业人员专门负责测定所有受试者的身高(脱鞋)、体重(脱外衣和鞋,身着单衣),计算BMI。受试者站立,双足分开25～30cm,使体重均匀分配,测量腰围、臀围,计算腰臀比(WHR)。采用人体成份分析仪INBODY SIO测定骨骼肌量、体脂肪量、体脂百分比(BFR)。(2)所受试者均禁食8h,空腹、安静状态下取静脉血4 m1,取血清,采用美国贝克曼DXC800全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL)、游离脂肪酸(FFA)、尿素(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)。采用高压液相法糖化血红蛋白(HbA1c)。采用直接化学发光法(ADVIA Centaur全自动免疫分析仪(西门子股份公司)测定空腹胰岛素(FINS).稳态模型胰岛素分泌指数(HOMA-β)=20×FINS/(FBG-3.5),稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5,估计肾小球滤过滤(eGFR)采用CKD-EPI公式计算。(3)采用酶联免疫吸附试验(ELISA,武汉Eiaab生物科技有限公司,批内变异系数4.8%,批间变异系数7.2%)测定血清Betatrophin,采用ELASA(美国凤凰制药有限公司,批内变异系数10%,批间变异系数15%)测定血清Irisin。(4)采用MTS实验(MTS检测试剂盒购于Promega公司)测定用药后INS-1细胞的活力。

结果:1.本次健康调查对象共有460例(男203名,占44.1%；女257名,占55.9%),所有研究对象均完成预定检查,其中2型糖尿病患者为60名,糖耐量正常人群254名,糖尿病前期146名。2型糖尿病患者中体质指数在18-28kg/m2有50名作为T2DM组,选取与其年龄、性别和BMI相匹配的糖耐量正常(NGT)者50名作为NGT组。T2DM组收缩压、体脂含量、eGFR、TG、FFA、FBG、hPG、 HbA1c、FINS、HOMA-IR、Betatrophin均显著高于NGT组(P值均0.01),两组间年龄、身高、体重、BMI、腰围、臀围、腰臀比、舒张压、体脂百分比、骨骼肌量,以及血清BUN、Cr、UA、CHO、HDL、LDL、HOMA-β、Irisin的差异均无统计学意义(P值均0.05)。2.T2DM组血清Betatrophin水平与身高(r=0.443,P=-0.001)、体重(r=0.478,P＜0.001)、BMI (r=0.402, P=0.004)、腰围(r=0.388, P=0.006)、Cr (r=0.348, P=0.013)呈正相关,而与Irisin、年龄、臀围、WHR、SBP、DBP、体脂肪量、BFR、骨骼肌量、BUN、UA、eGFR、CHO、TG、HDL、LDL、FFA、FPG、hPG、HhA1c、 FINS、HOMA-IR、HOMA-β不相关(P值均0.05)。NGT组血清Betatrophin水平与年龄(r=0.331,P=0.029)、Irisin (r=0.336,P=0.017)呈正相关(P0.05),与FINS (r=-0.353,P=0.013), HOMA-IR (r=-0.291,P=0.041)、 HOMA-β (r=-0.343,P=0.015)呈负相关,而与身高、体重、BMI、腰围、臀围、WHR、SBP、DBP、体脂肪量、BFR、骨骼肌、BUN、Cr、UA、CHO、TG、HDL、 LDL、FFA、FPG、2hPG、HbA1c、HOMA-IR不相关(P值均0.05)。3.两组均以血清Betatrophin为因变量,以体脂肪量、BFR、骨骼肌量、CHO、TG、2hPG、HOMA-IR、Irisin为自变量进行多重线性回归分析,T2DM组中CHO(β=-0.394)、TG (β=0.541)、2hPG (β=0.436)、HOMA-IR ( β=-0.388)是血清Betatrophin的独立相关因素(P值均0.05),NGT组上述指标均不相关(P值均0.05)。4.在NGT组中,与女性相比,男性血清betatrophin水平、身高、体重、BMI、腰围、臀围、腰臀比、Cr、UA、TG和FPG均高于女性(P0.05)；在T2DM组中,男性血清betatrophin水平、身高、体重、BMI、腰围、臀围、Cr和UA也高于女性,但TC和HDL却低于女性。5.与NGT组相比,T2DM组血清betatrophin水平高于NGT组；其中T2DM组中男性血清betatrophin水平亦高于NGT组男性,而T2DM组中女性血清betatrophin水平与NGT组女性相比,则差异没有统计学意义；另外,两组的男性血清betatrophin水平均高于女性。然而,对两组的血清irisin水平进行比较,差异没有统计学意义,且在性别分布上也没有统计学差异。6.NGT组中女性血清betatrophin水平与irisin呈正相关,与FINS呈负相关(P0.05)；而在NGT组男性、T2DM组男性和女性中血清betatrophin水平与irisin并不相关。在T2DM组中女性血清betatrophin水平与体重、BMI和臀围呈正相关,与FPG和HPMA-IR呈负相关(P0.05)。7.与对照组(Oh)比较,20mg/ml TNF-α (24h)组可显著抑制细胞的活力；与对照组比较,10nmol/l irisin可显著提高TNF-α处理后INS-1细胞的活力；与对照组比较,irisin各组均可显著提高TNF-α处理后INS-1细胞的活力。随着irisin预处理的时间的延长,TNF-α处理后INS-1细胞的活力逐渐提高,在4h时最高,接着细胞活力降低,但仍明显高于对照组。结论1.NGT组的血清Betatrophin水平明显低于新诊断2型糖尿病患者,且与Irisin呈正相关；新诊断2型糖尿病患者的血清Betatrophin水平则与Irisin不相关,而与BMI、腰围呈正相关,多重线性相关分析结果显示,其与TG、2h-PG呈正相关,与CHO、HOMA-IR呈负相关,提示糖耐量正常人群而非新诊断2型糖尿病患者血清Betatrophin水平与Irisin之间存在一定联系。2.NGT人群betatrophin水平明显低于新诊断T2DM患者,男性betatrophin水平明显高于女性。NGT人群中Betatrophin水平与irsin和FINS相关,而新诊断T2DM患者betatrophin水平则与irisin不相关。Betatrophin水平与体重、BMI和臀围呈正相关,与FPG和HOMA-IR呈负相关。这些结果提示betatrophin和irisin可能在2型糖尿病发病机制中发挥着重要作用,并且肝脏、脂肪组织和肌肉组织中可能存在某种细胞因子的交联作用。3.本研究结果显示irisin能明显提高TNF-α处理后INS-1细胞的活力,研究结果还需进一步的凋亡检测、Western Blotting及PCR等定量、定性实验进行证实,但本研究的结果为之后的研究提供了有力的证据和坚实的基础,继续深入研究Irisin对胰岛β细胞的作用及其机制的研究可能为T2DM防治提供新线索。